老年性黃斑變性（AMD）、視網膜色素變性（RP）等視網膜變性疾病是目前尚無有效治療手段的兇險致盲性眼病，也是公認的“視力殺手”。由中南大學愛爾眼科學院院長唐仕波教授、愛爾眼科研究所副所長陳建蘇教授帶領團隊，利用誘導多能干細胞（iPS）條件培養(yǎng)基和飛秒角膜透鏡，聯合構建高活性視網膜色素上皮細胞（RPE）的研究，不但有利于對視網膜色素上皮細胞生理特性、藥物篩選等研究，還有利于構建組織工程視網膜層及其移植。這將幫助科學家開發(fā)出應用組織工程RPE細胞片治療視網膜變性疾病和光感受器病變的新方法。
培養(yǎng)高活性的視網膜細胞
與年齡相關的老年性黃斑變性是發(fā)達國家50歲以上人群視力損害和致盲的首要病因，多達90%的病人無法治愈。數據顯示，發(fā)達國家年齡50歲以上黃斑變性的發(fā)病率達11%，目前我國的發(fā)病率接近發(fā)達國家，患病人數超過3000萬人，并以每年30萬人次的速度增加，成為我國現階段50歲以上年齡群體發(fā)病率最高的三大眼科疾病之一，而且女性呈現出比男性更高的危險性。
研究發(fā)現，未來最有希望治療老年性黃斑變性的方式是視網膜色素上皮細胞療法、視網膜黃斑部分的移植。那么，要采用RPE療法，就需要先培養(yǎng)健康的視網膜細胞。
陳建蘇告訴科技日報記者，取出死亡時間在3小時內捐獻者的帶有部分脈絡膜的視網膜組織，在解剖顯微鏡下可將帶有部分脈絡膜的RPE層從捐贈組織中分離出來，并培養(yǎng)出RPE細胞?！氨狙芯客ㄟ^半定量蛋白芯片分析鑒定，發(fā)現了包括血小板衍生生長因子AA（PDGF-AA）、胰島素樣生長因子結合蛋白2（IGFBP-2）等因子，在誘導多能干細胞上清液中，含量顯著增高，從而獲得大量增殖能力強、高活性及具有良好功能的RPE細胞。”
獲得類似視網膜自然結構的片狀組織
正常眼內的RPE細胞，是緊密連接的單層細胞，只有移植單層RPE細胞才有可能提高其存活率并發(fā)揮功能?；谶@個原因，研究團隊開始利用組織工程的方式，嘗試體外構建具有功能的RPE細胞片。
基因整合是指把兩個非同源基因連接起來。愛爾眼科團隊針對視網膜變性疾病展開進一步的研究，從患者的尿液、血液提取體細胞，進行體外擴增培養(yǎng)，并通過非基因整合型的方式進行重編程轉化，將患者的尿液、血液來源的細胞逆轉為具有自我復制及分化能力的誘導多能干細胞。
“通過研究，對轉化成功的尿液、血液來源的誘導多能干細胞，進行傳代純化并通過多能性基因表達、干性蛋白標志物免疫熒光及體外擬胚體試驗等方法進行鑒定，確認產生的誘導多能干細胞具有多向分化的能力?！睈蹱栄劭茖W院助理研究員顧佳寧說，后續(xù)通過3D分化培養(yǎng)方式，用不同的培養(yǎng)基對誘導多能干細胞進行視網膜方向的定向誘導分化，獲得視網膜器官發(fā)育的類似組織。并對其中出現色素表達的細胞，進行分離培養(yǎng)，得到RPE細胞，通過培養(yǎng)形成一層超薄的類似視網膜自然結構的片狀組織。
“但目前尿液及血液細胞的各種重編程方法效率均不高，往往要觀察半個月以上，才能確定是否重編程成功。因此，獲得患者體細胞來源的iPS細胞并不容易?！标惤ㄌK解釋說，對iPS細胞的誘導分化存在多種影響因素，如初始細胞的密度及iPS細胞狀態(tài)等。因此，通過iPS細胞誘導分化得到的RPE細胞色素表達情況不穩(wěn)定，還需進一步控制各個變量，獲得穩(wěn)定分化成優(yōu)質RPE細胞的誘導方法。
變角膜透鏡為支架材料
一個成功的RPE細胞片應具備三要素，即種子細胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和支架材料。除了高活性的種子細胞外，支架材料可有效保證細胞的黏附性，以及在移植時可確保細胞以正確的方向面對光感受器細胞。于是，研究團隊把全飛秒激光近視手術中切下取出的角膜基質透鏡“變廢為寶”，提高了其再利用價值。研究發(fā)現，當RPE細胞接種在角膜基質透鏡上，并應用誘導多能干細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，可以使RPE細胞片具有更多的干細胞特性、完善的纖毛組裝以及成熟功能。
此外，團隊還采用3D細胞培養(yǎng)、類器官等新技術，建立眼遺傳病患者疾病細胞模型，探明眼病發(fā)病和發(fā)展的機制及規(guī)律?；诎l(fā)病機理分析，對現有藥物做出個體化評估，以及發(fā)現新的治療靶點和篩選新藥物，獲得眼遺傳病及其他眼病新的治療方案。
“幾十年來，干細胞一直有望治愈疑難雜癥。該項研究將加速推動更安全的誘導多能干細胞療法的發(fā)展，同時，實驗已經證明了該項技術的安全性、有效性，為進行人體臨床試驗提供了充足依據?！碧剖瞬ㄕf。
